一、實驗目的
　　
　　掌握人類外周血細胞培養(yǎng)方法及染色體標本的制備方法。觀察人類染色體的形態(tài)和數(shù)目。
　　
　　二、實驗原理
　　
　　血液中的T淋巴細胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)一定劑量的植物血凝素（PHA）刺激，可以返幼進行細胞分裂，用秋水仙素積累分裂相，用0.075mol/L-1KCI進行低滲后，經(jīng)固定、染色，可見到分散的染色體。
　　
　　三、實驗準備
　　
　　超凈工作臺、紅外線滅菌器（艾本森儀器公司）、無菌注射器（1ml、2ml、5m1）、針頭、培養(yǎng)瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、離心機、定時鐘、試管架、量筒、刻度離心管、冰涼玻片，毛細滴管、恒溫水浴鍋、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸為3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配）、0.075mol。L-1KCI低滲液、Giemsa染液、pH6.8磷酸緩沖液、恒溫培養(yǎng)箱、吹風機、粗天平、5％NaHCO3、顯微鏡。
　　
　　四、實驗方法與步驟
　　
　　（一）接種
　　
　　取500單位/lml的肝素0。2ml濕潤針筒后，取靜脈血1～2ml，轉動針筒以混勻肝素；隨后立即插入滅菌小瓶內(nèi)，送入超凈工作臺（消毒、滅菌等略），在紅外線滅菌器旁將血液滴入2～3個盛有5ml培養(yǎng)液（4mlRPMIl640、lml小牛血清，5mgPHA，用5％的NaHCO3調(diào)pH至7.0～7.4）的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶0.2～0.3ml（7號針頭13滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。
　　
　　（二）培養(yǎng)
　　
　　1．將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h。
　　
　　2．在終止培養(yǎng)前2～4h，將0.01％的秋水仙素1～2滴（7號針頭）加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕輕搖勻．放回溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h。
　　
　　（三）收獲
　　
　　1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培養(yǎng)物移入刻度離心管內(nèi)，相對離心管平衡后放入離心機，離心8min（1000轉/分），吸去上清液，留下沉淀物。
　　
　　2．低滲處理：加8ml預溫（370C）的0.075mol。L-1KCI低滲液，用吸管打勻使細胞懸
　　
　　浮于低滲液中，放回37℃恒溫水浴鍋中，靜置15～20min，使白細胞膨脹，染色體分散、
　　
　　紅細胞解體。
　　
　　3．預固定：加入固定液1～2ml打勻。
　　
　　4．再離心：1000轉/分離心8min，吸去上清液，留下沉淀物。
　　
　　5．固定：沿離心管壁加入新配固定液8ml打勻，固定30min。
　　
　　6．再離心：1000轉/分離心8min，棄去上清液，留下沉淀物。
　　
　　7．再固定：再加入新配固定液8ml，打勻，靜置30min。
　　
　　8．再離心：1000轉/分離心8min，棄去上清液。
　　
　　9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打勻成細胞懸液。
　　
　　10．制片：用滴管吸細胞懸液2～3滴，滴在冰水預浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，在酒精燈上過幾次，吹風機吹干或氣干。
　　
　　11．染色：Giemsa染液（原液∶pH6.8磷酸緩沖液為1∶9）染色10min～20min、自來水沖洗、晾干。
　　
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　　低倍鏡下找到分散良好的分裂相后，換高倍鏡、油鏡、認真觀察。
　　
　　（五）注意事項
　　
　　1．PHA是體外淋巴細胞培養(yǎng)成敗的關鍵問題，因此，要考慮它的質(zhì)量和濃度。鹽水提取物一般冰凍保存的時間不宜過長，時間長了效價減低。
　　
　　2．濃度一般用1％～2％，每毫升培養(yǎng)液加0.2～0.4ml；濃度過高可能會導致紅細胞凝集。
　　
　　3．秋水仙素溶液濃度和處理時間。一般zui終濃度每毫升培養(yǎng)液0.1～0.2μg為宜，作用時間為3～5h，一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關系。如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊。
　　
　　4．培養(yǎng)溫度應嚴格控制在37℃+0.5℃。
　　
　　5．雙蒸水必須用玻璃蒸餾器制備，pH應在6～7之間。
　　
　　6．低滲步驟極為重要，關系到染色體分散的好壞，因此，低滲液濃度與低滲的時間應掌握適當。
　　
　　7．離心機用水平式的，速度不宜過快。速度太快細胞團不易打散，反之分裂相易丟失；固定液應在臨用時新鮮配制，固定一定要*、均勻。若打散不夠，則細胞在玻片上易集結。
　　
　　8．若吹打時用力過猛，細胞易破碎，以致染色體數(shù)目不完整；培養(yǎng)液的pH值應掌握在7.4土0.1左右，pH值偏酸發(fā)育不良，偏堿時細胞出現(xiàn)輕度固縮。
　　
　　9．玻璃器皿都要十分干凈、無酸，所用試劑以分析純?yōu)楹谩?br />　　
　　10．操作過程應保持高度無菌概念，嚴防細菌和病毒污染；在外周血培養(yǎng)中，PHA對淋巴細胞的作用，個體差異較大。同樣方法和條件，分裂相多少及分散情況不一樣。因此，若失敗，應充分考慮到這些因素。
　　
　　（五）預期實驗結果及分析
　　
　　將制作好的片子在油鏡下仔細觀察，選擇較好的分裂相進行照相、剪貼、分組，將照片上的核型進行剪貼，寫出實驗報告與實驗結果。
　　
　　染色體數(shù)目為46XX，（XY）為人類正常核型。若某對染色體少了一條（2n-1），細胞染色體數(shù)目為45；或某一對染色體多了一條（2n+1），細胞染色體數(shù)目為47；若為兩種核型，46，XX/46，XXY稱為嵌合體。以上三種為異常核型。
　　
　　艾本森的生產(chǎn)的紅外線滅菌器已經(jīng)在各個實驗廣泛應用，為各個實驗的成功提供了有力的保障。請大家認準ABSON品牌的紅外線滅菌器。